Samenvatting van dit proefschrift

Allereerst hebben we een inventarisatie gemaakt van de transcripten, die lokaal in de neurieten van regenererende neuronen voorkomen (hoofdstuk 2). Hiervoor is gebruik gemaakt van 2 verschillende methodes, namelijk (1) reverse Northern blot hybridisatie en (2) het screenen van een brein-specifieke cDNA bank. Bij de eerste methode wordt alleen gekeken naar al bekende transcripten en of deze voorkomen in de verzameling van transcripten, die geïsoleerd zijn uit de uitgroeiende neurieten. Met deze methode kon de aanwezigheid van een aantal bekende transcripten bevestigd worden. Het hybridisatie signaal was het sterkst voor b-tubuline, wat overeenkomstig is met eerder uitgevoerde studies.

Bij de tweede methode zijn alle in het brein voorkomende transcripten aanwezig in de cDNA bank en die worden vergeleken met de verzameling van transcripten, die geïsoleerd zijn uit de neurieten. Vervolgens wordt de identiteit van de overeenkomende transcripten bepaald. In totaal werden 200.000 brein-specifieke cDNAs gescreend wat resulteerde in de identificatie van 329 transcripten. Hieruit werden 23 unieke transcripten geïdentificeerd, welke coderen voor eiwitten die zijn betrokken bij Ca2+ regulatie, cytoskelet dynamica, neuropeptide synthese en afgifte, ion kanaal functionering, G-eiwit signalering en eiwit synthese.

Vervolgens is de neuritische lokalisatie van een aantal transcripten door ons bevestigd met behulp van in situ hybridisatie op zowel het complete zenuwstelsel als ook op losse neuronen (hoofdstuk 3). Met deze methode werd duidelijk, dat sommige transcripten zoals ß-tubuline, thymosine ß4 en pedal peptide niet zozeer in neurieten voorkomen, maar op speciale sub-neuritische plaatsen. Het meest opvallend is de sub-neuritische localisatie van het thymosine ß4 transcript. Deze leek te accumuleren bij buigpunten, wat een rol in sturing van de groeitip suggereert.

Ook hebben we onderzocht of de neuritische lokalisatie van bepaalde transcripten wordt gereguleerd door externe factoren.

Hiervoor hebben we bekeken of er verschil was in de hoeveelheid transcript in een neuriet wanneer deze synaptische contacten maakte of juist vrij uitgroeide zonder contacten te maken. Sommige transcripten waren inderdaad meer aanwezig in de neuriet wanneer deze contact maakte en andere transcripten waren juist minder aanwezig. De hoeveelheid transcript in het cellichaam werd niet beïnvloed door het maken van wel of juist geen contact. Onze conclusie is, dat het selectieve transport van de mRNAs naar de neuriet, of de stabiliteit van deze mRNA's in de neuriet, onder invloed staat van fysiologische aspecten.

Als laatste hebben we specifiek de rol van de lokale synthese van het eiwit thymosine ß4 in neuriet uitgroei bestudeerd (hoofdstuk 4). De thymosine ß4 mRNA expressie werd onderdrukt in intacte neuronen met behulp van dsRNA. Dit resulteerde in een 3-voudige toename van de neuriet lengte wanneer deze werd vergeleken met de uitgroei van controle neuronen. Dit is ook wat wij verwachtten gezien de functie van ß-thymosines als actine bindende eiwitten waardoor ze de actine polymerisatie en dus uitgroei inhiberen. Dit suggereert, dat thymosine ß4 betrokken is bij de controle van neuriet uitgroei in het aspect van het stoppen dan wel vertragen van de groeitip tijdens het maken van vertakkingen, buigen of synaps vorming. Dit is in overeenstemming met de accumulatie van thymosine ß4 transcript in buigpunten.

Natuurlijk hebben we deze dsRNA experimenten ook uitgevoerd met geïsoleerde neurieten, wat een vergelijkbare toename in neuriet uitgroei liet zien. Aangezien de neurieten niet langer vast zaten aan het cellichaam op het moment dat de dsRNA werd toegevoegd aan het kweekschaaltje, kunnen onze bevindingen alleen verklaard worden door de aanname dat de uitgroei snelheid van de neurieten op zijn minst gedeeltelijk onder invloed is van het lokaal vertaalde thymosine ß4.