SUMMARY

Rab3A is een van de vele Rab eiwitten (een mensencel heeft zo'n 60 verschillende typen) en maakt deel uit van de subklasse van Rab3 eiwitten waarvan 4 verschillende typen bestaan (A t/m D). Deze Rab eiwitten fungeren als een schakelaars: in de "aan" stand is bevatten ze een molecuul van hoge energie waarde, genaamd guanine-tri-fosfaat ofwel GTP. De Rab eiwitten kunnen dit molecuul omzetten in een lagere energiewaarde, guanine-di-fosfaat (GDP) waardoor ze in de "uit" stand terecht komt.

In de aan GTP-stand zijn Rab eiwitten vooraal te vinden aan membranen in de cel. De subklasse van Rab3 eiwitten zijn dit de membranen van synaptische blaasjes en LDCVs. In deze stand kunnen ze op hun beurt allerlei andere eiwitten aantrekken naar het neurotransmitter blaasje (zogenaamde effector eiwitten). Op het moment dat het blaasje versmelt met de celmembraan en de neurotransmitters worden afgegeven zetten de Rab3 moleculen GTP om in GDP en laten daarmee de effector eiwitten los. In deze GDP-stand worden de Rab3 eiwitten van de membraan afgehaald door een eiwit genaamd GDI ("GDP dissociation inhibitor"). Van alle Rab3 eiwitten is het Rab3A subtype het meest voorkomend in neuronen en men denkt dat dit eiwit een belangrijke rol speelt in de afgifte van neurotransmitters. Al sinds de jaren 80 buigen wetenschappers zich over de vraag welke invloed de Rab3a schakelaar heeft op neurotransmitter blaasjes, maar er is tot nu toe nog geen bevredigend antwoord gevonden. In dit proefschrift heb ik geprobeerd meer informatie te verzamelen over de invloed van Rab3A in verschillende fasen van de levens cyclus van neurotransmitter blaasjes om zo tot een hypothese te komen over de rol van Rab3A in neurotransmitterafgifte.

In hoofdstuk 2 beschrijf ik de resultaten van experimenten die de rol van de GDP/GTP schakelfunctie van Rab3A onderzoeken in het aanmeren van LDCVs aan de cel membraan. Voor dit onderzoek heb ik chromaffine cellen gebruikt, dit zijn cellen uit de bijnier die veel LDCVs bevatten en in vele opzichten lijken op neuronen. Als ik een overmaat aan Rab3A in deze cellen breng, zag ik dat er meer LDCVs aanmeren aan de cel membraan, terwijl mutante vormen van Rab3A die continu in dan wel de GTP of de GDP stand staan dit proces niet kunnen stimuleren. Hieruit blijkt dat het schakelen tussen de GTP en de GDP stand dus belangrijk is voor deze functie van Rab3A. Uit eerder onderzoek is gebleken dat een eiwit genaamd Munc-18 essentieel is voor het aanmeer proces van LDCVs. Om te kijken hoe Rab3A en Munc18 zich verhouden heb ik een overmaat aan Rab3A in chromaffine cellen gebracht die geen Munc-18 bevatten. In deze cellen zag ik dat Rab3A niet meer in staat is om het aanmeren van LDCVs te bevorderen en dat de mutante vormen van Rab3A zelfs een remmende werking hebben op dit proces. Uit deze experimenten blijkt dat Rab3A Munc18 nodig heeft om het aanmeren van blaasjes te stimuleren en dat de blaasjes die zonder Munc18 toch nog aankomen aan de celmembraan gevoelig zijn voor de schakelfunctie van Rab3A.

Hoofdstuk 3 beschrijft de rol van de totale Rab3 familie in het aanmeren en afgeven van LDCVs in chromaffine cellen. Voor deze experimenten heb ik muizen gebruikt die alle Rab3 eiwitten missen. Deze muizen sterven kort na geboorte, wat aangeeft dat de Rab3 eiwitten erg belangrijk zijn voor lichaamsfuncties. Als we naar het aanmeren van blaasjes kijken zien we geen effect van het ontbreken van alle Rab3 eiwitten. Dit geeft aan de Rab3A weliswaar het proces kan stimuleren, maar op zich niet essentieel is. De afgifte van LDCVs is daarentegen wel aangedaan, en dan met name de eerste fase van het afgeven van LDCVs na het verhogen van het interne calcium gehalte. Dit betekent dat hoewel de LDCVs wel klaarliggen om afgegeven te worden, er nog een stap ontbreekt die ze ook in staat stelt om met de celmembraan te versmelten. Dit proces noemen we priming. Daarnaast vonden we dat het totaal aantal blaasjes in de cel in afgenomen in cellen zonder Rab3. Aangezien de afgifte van blaasjes in deze cellen is gehinderd, is het onwaarschijnlijk dat deze blaasjes verdwenen zijn via spontane afgifte. De overblijvende verklaring is dat de aanmaak van LDCVs in afwezigheid van Rab3 eiwitten minder goed verloopt.

Hoofdstuk 4 betrekt een tweede subgroep van Rab eiwitten in het geheel, de subklasse Rab27. Deze groep bestaat uit twee typen (A en B) en kan soortgelijke functies vervullen als de Rab3 subklasse, waaronder het binden aan dezelfde effector eiwitten. In dit hoofdstuk beschrijf ik de effecten van het verwijderen van zowel Rab3A als Rab27A in muizen. In tegenstelling tot muizen die alle Rab3 eiwitten missen, zijn deze muizen levensvatbaar en kunnen zich normaal voortplanten. De afwezigheid van Rab27A heeft geen invloed op het gedrag van de muizen, maar muizen zonder Rab3A bleken minder angstig te zijn. Als we kijken naar de chromaffine cellen van de muizen zonder Rab3A en Rab27A, vinden we geen effecten om het aanmeren van LDCVs. Ook het afgeven van synaptische blaasjes en LDCVs in neuronen van deze dieren verloopt normaal. Echter, we vonden een klein maar consistent effect op het recycling proces van zowel synaptische blaasjes al LDCVs, wat suggereert dat deze Rab eiwitten dus ook invloed uitoefenen op deze fase van de levenscyclus van neurotransmitter blaasjes.

In hoofdstuk 5 heb ik een van de effector eiwitten onder de loep genomen die zowel in chromaffine cellen als neuronen voorkomt: Rabphilin-3A. Dit eiwit kan calcium registreren, LDCVs aan het actine skelet van de cel linken en binden aan eiwitten die essentieel zijn voor de afgifte van neurotransmitter blaasjes. Aangezien ik in hoofdstuk 2 heb gevonden dat het schakelen tussen GTP en GDP van Rab3A belangrijk is voor het aanmeer proces van LDCVs in chromaffine cellen, stel ik hier de vraag of Rabphilin-3a misschien het effector eiwit is wat dit effect op het aanmeren verder bewerkstelligt. Verder is in de literatuur al beschreven dat Rabphilin-3A LDCVs dichter bij de membraan kan brengen. Tot mijn verrassing zag ik echter minder LDCVs in de buurt van de membraan als ik een overmaat aan Rabphilin-3A in chromaffine cellen breng. De hoeveelheid aangemeerde blaasjes was zelfs gehalveerd. De LDCVs lagen als clusters in het cytoplasma van de chromaffine cellen. Om te achterhalen wat hier nu aan de hand is, heb ik eerst het actine skelet van de cellen beïnvloed maar dat had geen effect of de LDCV clusters. Verder heb ik een paar kleine testen gedaan op cellen die dan wel geen Munc-18 (hoofdstuk 2) of geen Rab3A/Rab27A (de muizen van hoofdstuk 4) hebben, maar ook daar leek geen oplossing in het verschiet.

Het is aannemelijk dat het clusteren van LDCVs komt door een te grote overmaat aan Rabphilin-3A waardoor cellen onnatuurlijk gedrag gaan vertonen. Echter, dit is de eerste keer dat ik zoiets heb gezien en ook een eiwit wat erg lijkt op Rabphilin-3A, Doc2B, heeft niet dit effect. Het zou dus kunnen zijn dat deze LDCVs clusters een versterking zijn van een natuurlijke functie van Rabphin-3A, maar ik heb het experiment om dat aan te tonen niet kunnen uitvoeren.

Hoofdstuk 6 is een technisch hoofdstuk, het beschrijft de ontwikkeling van een computerprogramma dat ik heb gebruikt om de LDCVs te analyseren in EM plaatjes van chromaffine cellen. De uitkomst is dat het programma erg goed werkt, niet alleen op chromaffine preparaten maar ook op andere cellen die LDCVs bevatten.

Alle resultaten worden bediscussieerd in hoofdstuk 7 wat uiteindelijk leidt tot de volgende hypothese: Aangezien Rab3A invloed heeft op de aanmaak (hoofdstuk 3), het aanmeren (hoofdstuk 2), het afgeven (hoofdstuk 3) en het recyclen (hoofdstuk 4) van neurotransmitter blaasjes en al deze stappen stimuleert, lijkt het erop dat Rab3A de hele levenscyclus van deze blaasjes versnelt.